循環(huán)腫瘤細胞 (CTC) 與循環(huán)腫瘤血管內皮細胞 (CTEC)

實(shí)體腫瘤中的某些腫瘤細胞 (Tumor Cell, TC) 可侵潤血管 (主動(dòng)性?xún)葷B)，脫落并進(jìn)入血液循環(huán)系統形成循環(huán)腫瘤細胞 (Circulating Tumor Cell, CTC)。其中，某些 CTC 可由血液帶至某一特定器官處后，粘附、侵潤并穿出血管 (主動(dòng)性外滲)，最終形成新的腫瘤轉移灶。腫瘤復發(fā)與腫瘤轉移有著(zhù)類(lèi)似的過(guò)程。腫瘤組織富含大量血管。與正常組織血管壁上的內皮細胞不同，腫瘤組織血管壁上的內皮細胞被稱(chēng)為“腫瘤血管內皮細胞”(Tumor-derived Endothelial Cell, TEC) (Hida and Klagsbrun, 2005 Cancer Res 65:2507)。這些細胞脫落入血后形成“循環(huán)腫瘤血管內皮細胞”(Circulating TEC, CTEC) (Lin et al., 2017 Sci Rep 7:9789)。TC/CTC 及 TEC/CTEC 均具有腫瘤的典型標志 - 染色體異倍體。CTC 與 CTEC 共同構成了一對“細胞型循環(huán)腫瘤生物標志物”，在腫瘤血管生成及腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉移、耐藥、復發(fā)等過(guò)程中相互協(xié)調，發(fā)揮著(zhù)極為重要的作用。目前已證明，CD31^- 腫瘤細胞在體內低氧的腫瘤微環(huán)境中或腫瘤細胞體外低氧培養條件下，可轉分化 (transdifferentiation) 成為 CD31⁺ 腫瘤血管內皮細胞 (Lin, 2020 Cells 9:1539)。

應用賽特 SE-i?FISH^? 檢測 CTC 及 CTEC

賽特生物與美國 Cytelligen 公司密切合作，在世界上首次成功將差相富集 (SE) 與免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交 (i·FISH) 整合為獨特的 SE-i·FISH 技術(shù)平臺。該技術(shù)擁有國內外 CTC 分離、鑒別的兩項國家發(fā)明專(zhuān)利 (ZL 2009 1 0137289.0，ZL 2011 1 0340544.9) ，可有效檢測腫瘤患者或腫瘤動(dòng)物模型中的 CTC、循環(huán)腫瘤血管內皮細胞 CTEC 及其各種亞類(lèi)細胞。SE-i·FISH 已被成功應用于以下多種 CTC 及 CTEC 的相關(guān)臨床檢測。CTC 最近也已被納入美國 NCCN 及 AJCC 腫瘤分期指南。

迄今為止，賽特生物團隊已與上百家國內外知名醫院、科研院所（如美國 UCLA、UCSD、Scripps、德國慕尼黑大學(xué)醫學(xué)中心、北京協(xié)和醫院、中國醫學(xué)科學(xué)院腫瘤醫院/中國國家癌癥中心、北京大學(xué)腫瘤中心、上海華山醫院、四川大學(xué)華西醫院等）及多家制藥公司密切合作，對近4萬(wàn)例涵蓋各種實(shí)體腫瘤的大樣本上進(jìn)行臨床驗證，在 CTC 的臨床應用（如腫瘤早診、療效快速評估、耐藥與復發(fā)的實(shí)時(shí)性監測等）及 CTC 單細胞研究等領(lǐng)域取得了豐碩成果，在《Clinical Cancer Research》、《Science Advances》等多個(gè)國際著(zhù)名雜志上發(fā)表了多篇 SCI 高分論文。國際頂級期刊“科學(xué)”雜志已將獨特的賽特 SE-i·FISH 作為最具有代表性的 CTC 檢測技術(shù)向全球讀者進(jìn)行了報道 (Science 2013, 341:415) 。由國家科技部、衛計委共同組建的腫瘤轉化醫療平臺，也將賽特生物的 SE-i·FISH 作為 CTC 的主要檢測技術(shù)向國內外廣大腫瘤界同行進(jìn)行了推薦 (http://101.200.216.160:888/yyfw/285.jhtml) 。

差相富集技術(shù) (Subtraction Enrichment, SE)

差相富集技術(shù)的主要作用原理是應用與白細胞相結合的免疫磁珠及特殊密度的非血源性細胞分離介質(zhì)快速、高效地去除血液中絕大多數的白細胞、紅細胞及血漿蛋白，從而達到從人或腫瘤動(dòng)物模型體液中有效富集非血源性腫瘤細胞的目的。

賽特免疫磁珠的高特異性：

由特殊工藝制備的 Cytelligen 賽特免疫磁珠偶聯(lián)了多種抗白細胞抗體以確保對白細胞的最佳去除效果。該免疫磁珠上的抗體僅與血源性白細胞相結合，而與非血源性腫瘤細胞無(wú)交叉反應。磁珠表面的特殊包被工藝確保了免疫磁珠與各種細胞不發(fā)生非特異性粘附。

因富集過(guò)程不依賴(lài)腫瘤細胞表面標示物的表達，故可通用于所有不同實(shí)體腫瘤來(lái)源的 CTC 富集。富集過(guò)程中由于避免使用抗體直接抓取細胞及避免使用低滲溶破法去除紅細胞，所以富集后的腫瘤細胞維持了很好的自然狀態(tài)及很高的生物活性，適于后續原代腫瘤細胞培養及一系列各種形態(tài)學(xué)與功能性的相關(guān)研究。此外，SE 也可以有效富集分離各種大小不同的 CTC 、細胞團（癌栓，circulating tumor microemboli, CTM）。差相富集技術(shù)從技術(shù)層面解決了以往常見(jiàn)的 CTC 捕獲效率及捕獲豐度較低的問(wèn)題，具有“非依賴(lài)、全亞型、高捕獲率、高活性”等特點(diǎn)。

各種 CTC 分離方法比較 

SE-i?FISH^? 技術(shù)有效區分、鑒別“細胞型循環(huán)腫瘤標志物”CTC 與 CTEC

為了確保高靈敏、高特異性地有效檢測、分型各種 CTC 及 CTEC，賽特生物將細胞內生物鏈三要素（核酸、蛋白及細胞形態(tài)）整體考量，開(kāi)發(fā)出了 i·FISH 整合技術(shù)平臺，以同步、原位檢測細胞上的染色體核型、腫瘤標志物蛋白表型及細胞形態(tài)。 i·FISH 鑒別技術(shù)實(shí)現了對富集的 CTC 進(jìn)行核酸水平和蛋白水平的同步、原位雙重鑒定，將免疫熒光染色與染色體熒光原位雜交 (FISH) 進(jìn)行了有效整合，使得 CTC 計數、核型分析、表型分析、分子分型一步到位。

依據特定瘤標表達的有無(wú)、強弱及染色體的異常倍體特性，可以鑒別出具有不同臨床意義（如耐藥、腫瘤轉移與復發(fā)等）的各種 CTC 及 CTEC 亞類(lèi)細胞。從而為進(jìn)一步探索 CTC、CTEC 及其亞類(lèi)與腫瘤的預后、轉移、耐藥、復發(fā)等的相關(guān)性研究提供堅實(shí)的基礎與可靠的依據。大量臨床實(shí)驗證明，相對于傳統的細胞形態(tài)學(xué)檢查或目前常規的 CK 染色判斷 CTC，i·FISH 具有其它方法無(wú)可比擬的一系列特殊優(yōu)勢。

SE-i?FISH^? 的獨特技術(shù)優(yōu)勢

SE-i?FISH^? (NC) 有效區分及全方位聯(lián)合檢測活性與壞死細胞 CTC、CTEC (necrotic cell, NC)

（1）在SE-iFISH 基礎上有效富集、鑒別及聯(lián)合檢測各種活性與壞死異倍體 CTC、CTEC 亞類(lèi)細胞

（2）可用于基礎、轉化醫學(xué)研究及臨床快速評估療效、動(dòng)態(tài)監測腫瘤轉移、耐藥及進(jìn)展

（3）有效檢測患者接受全程治療后殘存的與腫瘤耐藥及復發(fā)密切相關(guān)的腫瘤微小殘留病灶 (MRD) CTC 、CTEC 活細胞